2019年10月1日，5-羥甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究領域取得重要進展。2型糖尿?。═2D）的血管并發癥是導致2型糖尿病致殘致死的重要病因，一直缺乏一種無創便捷的臨床途徑實現血管并發癥的發生發展監測，達到早發現、早干預，以提高T2D病人的整體生活質量，減少衛生經濟負擔。

      該研究入組了62例2型糖尿病病人，采用5hmC-Seal技術對血漿cfDNA中表觀遺傳標志物5hmC的分布情況進行檢測，分析5hmC標志物與2型糖尿病血管并發癥發生發展的相關性。結果表明5hmC標志物的變化與T2D合并大血管/微血管事件具有相關性，主要涉及一些與血管生物學和糖尿?。òㄒ葝u素抵抗和炎癥反應）相關的基因和信號通路。該研究建立的16個基因-5hmC標志物組合檢測可以準確區分有并發癥和無并發癥的2型糖尿病病人[實驗組：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明顯優于傳統臨床變量例如白蛋白尿。除此之外，還建立了13個基因-5hmC標志物組合檢測，可以進一步區分T2D合并單一并發癥和多種并發癥[實驗組：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同樣明顯優于其他傳統臨床變量。該研究得出結論，5hmC標志物反映了T2D病人大血管/微血管并發癥發生過程中的表觀遺傳變化，因而5hmC-Seal檢測技術在監測糖尿病血管并發癥發生和進展方面具有良好的臨床應用前景。

試驗設計

   本研究共納入62例2型糖尿病病人，包括沒有血管并發癥的病人12例，有單一血管并發癥的病人34例（24例發生大血管事件，10例發生微血管事件），以及有多種血管并發癥的病人16例。試驗收集62例病人血漿，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技術捕獲外周血cfDNA中的5hmC序列，進行二代測序，通過生物信息學分析找出并發癥組與無并發癥組之間有顯著5hmC修飾差異的基因，單一并發癥組和多種并發癥組之間有顯著5hmC修飾差異的基因。隨后利用回歸模型對差異基因進一步篩選、優化，彈性網絡進一步篩選，計算加權平均分，最后得到一組具有高度靈敏度和特異性的5hmC生物標記物，并進一步在實驗組中驗證，分析其靈敏度和特異性。并將新建立的5hmC標志物基因組合的檢測性能與傳統臨床變量進行對比分析。最后對相關基因進行了信號通路分析和功能探究。

研究結果

5hmC修飾水平與血管并發癥具有相關性

    之后將有單一并發癥或多種并發癥的50例病人用邏輯回歸模型進行了對比，發現多種并發癥的病人的153個差異修飾候選基因（包括上調和下調基因）的歸一化平均數要低于無并發癥病人（P<0.001）。

5hmC標志物可區分有無并發癥患者

62例2型糖尿病病人被隨機分成訓練組（n=31）和測試組（n=31）。利用彈性網絡篩選后發現，16基因-5hmC標志物組合檢測可以用于區分有并發癥和無并發癥的2型糖尿病病人?；?6基因組合模型 (Detection Model1) 的加權平均分分析，發現無并發癥病人的分數在訓練集和測試集中都明顯低于有并發癥的病人。只考慮加權平均分的話，受試者工作特征曲線（ROC）分析表明將cutoff值設置成0.5時，在測試組中中的靈敏度為60%，特異性為100%。

5hmC標志物可區分病人是單一并發癥還是多種并發癥

50例有并發癥的2型糖尿病病人被隨機分成訓練組（n=25）和測試組（n=25）。利用彈性網絡篩選后發現，13基因-5hmC標志物組合可以區分2型糖尿病病人是否發生單一并發癥或多種并發癥?；?3基因組合模型 (Detection Model 2)， 我們計算了單一并發癥和多種并發癥的加權平均分，發現在訓練集和測試集中單一并發癥和多種并發癥病人的分數都有明顯差異。值得一提的是，有腎病并發癥和無腎病并發癥病人的分數也有明顯差異。利用加權平均分作為判斷標準的受試者工作特征曲線（ROC）表明，在測試組中當將cutoff值設成0.69時，靈敏度為87.5%，特異性為68.8%。

5hmC標志物與傳統臨床變量/危險因子的對比

我們評估了不同臨床變量/危險因子用于監測血管并發癥的靈敏度和特異性（見表1）。

    總體來說，結果表明一些臨床變量（如尿液白蛋白、血清ALT、AST、肌酐、GGT、脂蛋白a）雖然具有一定的靈敏度和特異性，但是整體準確度仍然差強人意，因此臨床需要更加準確的方法。另外，我們還在訓練組中建立5hmC和不同臨床變量的多變量組合模型進行評估，該模型加權平均分的AUC要明顯大于傳統臨床變量的AUC。若將這些臨床變量與加權平均分進行結合，AUC也將進一步提高。因此，該多變量模型表明加權平均分可作為一個獨立的指標用于監測2型糖尿病血管并發癥。

信號通路分析和功能探究

有并發癥和無并發癥病人的135個差異候選基因的功能注釋分析表明，這些基因主要富集在一些經典的信號通路。錯誤發現率相關P值位于前10%和基因數目≥3的信號通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介導的信號通路。由IGF1R和IL-10介導的信號通路與胰島素抵抗及炎癥反應相關，在血管生物學和糖尿病發生發展過程中發揮重要作用。

    Reactome相互作用網絡的中心表明，泛素編碼基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亞基核糖體蛋白融合產物1(UBA52)]是候選基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要連接者。在這135個差異候選基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表現出與糖尿病病程相關的傾向，表明5hmC和糖尿病血管并發癥之間可能存在時間依賴性的相互作用?；诳v向時間隊列的大樣本研究，將可進一步明確5hmC變化和糖尿病持續時間之間的動態關聯。關于單一并發癥和多種并發癥病人的159個候選標志基因的功能注釋研究發現，存在細胞-細胞連接、膠原蛋白形成、新陳代謝、細胞應激應答信號通路的富集，這些信號通路均與細胞基本功能密切相關。

研究意義

血管并發癥是三分之二糖尿病病人的死亡原因，若能及早有效控制血管并發癥的發生，將極大地改善糖尿病病人的生存質量。該研究建立了一種利用cfDNA進行2型糖尿病血管并發癥監測的無創便捷方法，較目前臨床標志物能更準確地監控血管并發癥的發生，從而提示臨床及早采取應對措施，有效控制病情進展。

背景介紹

1、研究者介紹

何川，美國芝加哥大學化學系終身教授、John T. Wilson講席教授、芝加哥大學生物物理動力學研究院主任、芝加哥大學癌癥研究中心會員、美國霍華德休斯醫學研究所（HHMI）研究員、北京大學長江講座教授，開設合成與功能分子生物中心，并任主任；參與籌建北京大學未來基因診斷高精尖創新中心；迄今已經發表300篇SCI學術論文，在國際頂尖期刊（Nature、Science、Cell）正刊發表研究文章超過20篇。2017年2月22日，《Nature》 News大篇幅介紹何川教授利用化學標記方法重新發現了DNA和RNA的表觀遺傳功能以及該領域的發展過程，充分肯定何川教授在表觀遺傳學研究中的開拓性貢獻。

張瑋，美國西北大學芬伯格醫學院預防醫學系、Lurie癌癥研究中心、以及遺傳醫學中心教授，并兼任伊利諾伊大學醫學院藥理系教授。生物信息學及大數據分析專家，長期從事癌癥生物標志物、人類遺傳學、癌癥藥物基因組學的研究工作，發表SCI論文140余篇，專著3部，論文被引用超過5000次。曾獲美國癌癥研究學會Merck Co.學者獎，多種學術期刊編委和審稿人，以及美國NIH/NCI癌癥分析技術專項基金的評審委員。

    劉松梅，武漢大學醫學部檢驗系/中南醫院檢驗科教授，博士生導師。主要研究腫瘤與代謝性疾病的表觀遺傳學，主持國家自然科學基金、湖北省自然科學基金創新群體等項目10余項，參與973和重大研究計劃各1項，發表SCI論文40余篇。其中單篇最高影響因子17.728，單篇最高他引100余次。曾獲湖北省科技進步一等級獎，是多種學術期刊的審稿人和國家自然科學基金評審專家。

2、5hmC背景介紹

5-甲基胞嘧啶(5mC)是DNA胞嘧啶環中第五碳通過脫氧核苷酸甲基轉移酶（DNMT）甲基化所形成，在哺乳動物胚胎發育以及疾病發生發展中起著重要的作用。5mC經過Ten-eleven translocation(TET)的氧化作用形成5hmC，研究顯示羥甲基化在正?；蚪M中表達量相對穩定，表明羥甲基化有獨特的表觀修飾作用，不僅僅是5mC代謝的中間產物。5hmC與包括癌癥在內的多種疾病相關，在多種腫瘤組織中低水平的5hmC得到證實。5hmC水平的高低與腫瘤的類型及臨床分期也有著密切的關系，如肺癌中，隨著病理分期發展，5hmC的水平進行性下降。腸癌、胃癌和食管癌的臨床研究也顯示出來5hmC能夠準確區分癌癥患者和健康對照人群，在胃癌的臨床數據中可以看到靈敏度和特異性可同時達到90%以上，具有較高的臨床應用價值。有關肝癌的大樣本（2554例）的臨床研究顯示，5hmC模型不僅可以準確區分早期肝癌患者和健康對照人群，同時還可區分早期肝癌患者和慢性乙肝患者或肝硬化患者，5hmC診斷模型具有肝癌組織特異性特征?；诨瘜W捕獲的5hmC檢測技術是一種新的液體活檢技術，利用高通量測序并比對分析的方法可獲得更為精確的5hmC的基因圖譜。利用該技術，將推動表觀遺傳標志物5hmC在臨床上的進一步應用。